加味柴芍六君方联合壮医药线点灸对胃癌前病变模型大鼠的作用
蒋敏玲，范剑薇，江伟
桂林医学院附属医院，广西桂林 541515
摘要：目的：探讨加味柴芍六君方联合壮医药线点灸对胃癌前病变模型大鼠的作用。方法：将120只健康清洁级雄性Wistar大鼠随机分为6组，即空白对照组、模型对照组、胃复春对照组、中药低剂量组、中药中剂量组及中药高剂量组，均20只。空白对照组正常进食水，其他5组采用综合法造胃癌前病变(Precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)模型。造模成功后，各组给予对应的药物干预（中药组同时配合壮医药线点灸外治）后断头处死取胃。采用免疫组化S-P法检测脾酪氨酸激酶（Syk）、突变型p53蛋白及生存素（Survivin）的表达水平，观察胃黏膜组织病理，分析其干预胃癌前病变的作用机制。结果：药物干预期间，中药中剂量组、高剂量组大鼠毛色发黄，大便溏结不调，耳朵黏膜色泽差，进食量减少，精神萎靡，反应迟钝等症状基本消失，干预6周后恢复正常；胃复春对照组及中药低剂量组上述症状有所改善，但改善效果没有中药中剂量组、高剂量组明显；模型组毛色发黄，大便溏结不调，耳朵黏膜色泽差，进食量减少，精神萎靡，反应迟钝；和模型组相比，胃复春对照组、中药低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠的体质量均明显较高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中药中剂量组、高剂量组大鼠体质量明显高于胃复春对照组及中药低剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和模型组相比，中药高剂量组腺体萎缩、肠上皮化生发生例数均明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和模型组相比，胃复春对照组、中药中剂量组、高剂量组大鼠Syk蛋白阳性表达情况明显增加，阴性表达情况明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和胃复春对照组相比，中药高剂量组大鼠Syk蛋白阳性表达情况明显增加，阴性表达情况明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和模型组相比，胃复春对照组、中药中剂量组、高剂量组大鼠Survivin蛋白阳性表达情况明显减少，阴性表达情况明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和胃复春对照组相比，中药高剂量组大鼠Survivin蛋白阳性表达情况明显减少，阴性表达情况明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和模型组相比，胃复春对照组、中药高剂量组大鼠p53蛋白阳性表达明显减少，阴性表达明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：对胃癌前病变模型大鼠应用加味柴芍六君方联合壮医药线点灸治疗，可显著提高治疗效果，而增强Syk蛋白的表达和减弱Survivin蛋白、p53蛋白的表达，可能是其作用机制。
关键词：胃癌前病变；加味柴芍六君方；壮医药线点灸；大鼠；肿瘤
The effect of the model rat with Gastric precancerous lesions treated by Chaishao Liujun Soap combines the medicated thread moxibustion of Zhuang
Jiang Minling Fan Jianwei Jiang Wei
Dept of Traditional Chinese Medicine,Affiliated Hospital of Guilin Medical College Guilin Guangxi 541515
[Abstract] Objective: To discuss the effect of the model rat with Gastric precancerous lesions treated by Chaishao Liujun Soap combines the medicated thread moxibustion of Zhuang. Methods: To randomly divided the 120 cases health clean male Wistar rats into 6 groups, they were the blank control group, model control group, Weifuchun control group, low-dose of TCM group, middle-dose of TCM group and high-dose of TCM group, each 20 cases. The blank control group was given normally food and water, the other 5 groups was built the PLGC model by comprehensive method. After built successfully, each group was given the corresponding pharmacological intervention (the TCM groups was given the medicated thread moxibustion of Zhuang for treatment at the same time), to thereafter decapitated and took out the stomach. To detected the tyrosine kinase (Syk), expression level of mutant p53 protein and Survivin by immunohistochemical s-p method, to observed histopathology of gastric mucosa, analysed the functional mechanism of that intervened the gastric precancerous lesions. Results: During the period of pharmacological intervention, the color was yellow, excrement was stool sometimes sloppy and sometimes bound, food-intake was reduced, spirits were drooping, lags in response and other symptoms were basically disappeared of the middle and high dose of TCM groups, and to got right after intervention for 6 weeks. The above symptoms of the Weifuchun control group and low-dose of TCM group was improved, but the improved effect was more obviously than the middle and high dose of TCM groups. The color was yellow, excrement was stool sometimes sloppy and sometimes bound, the colour and lustre was not good of ear mucosa, food-intake was reduced, spirits were drooping and lags in response of the model group. To compared with the model group, the weight of the Weifuchun control group, low, middle and high dose of TCM groups was significantly higher, there was statistical significance (P<0.05). The rat weight of the the middle and high dose of TCM groups was significantly higher than the Weifuchun control group and low-dose of TCM group, there was statistical significance (P<0.05). To compared with the model group, the occurred cases of glandular atrophy and intestinal epithelium was significantly reduced , there was statistical significance (P<0.05). To compared with the model group, the cases of positive expression of Syk Protein of the rats of the Weifuchun control group and middle and high dose of TCM groups was significantly increased, the cases of negative expression was significantly reduced, there was statistical significance (P<0.05). To compared with the Weifuchun control group, the cases of positive expression of Syk Protein of the rats of the high dose of TCM group was significantly increased, the cases of negative expression was significantly reduced, there was statistical significance (P<0.05). To compared with the model group, the cases of positive expression of Survivin Protein of the rats of the Weifuchun control group and middle and high dose of TCM groups was significantly reduced, the cases of negative expression was significantly increased, there was statistical significance (P<0.05). To compared with the Weifuchun control group, the cases of positive expression of Survivin Protein of the rats of the high dose of TCM group was significantly reduced, the cases of negative expression was significantly increased, there was statistical significance (P<0.05). To compared with the model group, the cases of positive expression of p53 Protein of the rats of the Weifuchun control group and high dose of TCM group was significantly reduced, the cases of negative expression was significantly increased, there was statistical significance (P<0.05). Conclusion: That able to effective improve the treatment effect of the model rat with Gastric precancerous lesions treated by Chaishao Liujun Soap combines the medicated thread moxibustion of Zhuang, but to increase the expression of the Syk Protein and weaken the expression of the Survivin Protein and p53 Protein, that could be the functional mechanism.
[Keywords] Chaishao Liujun Soap, Medicated thread moxibustion of Zhuang, Model rat with Gastric precancerous lesions, Combine
胃癌是临床常见的一种恶性肿瘤，具有较高的发病率和病死率[1]。胃癌患者常表现出上腹不适、食欲减退、贫血、日益消瘦、呕血及黑便等症状，严重威胁着人类的健康[2-3]。胃癌的产生是步骤较多、原因复杂的一个发展过程，常常要经历胃癌前病变的阶段[4]。胃癌前病变是指从正常胃黏膜向胃癌转化过程中的一个阶段[5]。中医文献中暂无本病的病名，部分学者将其归属于“吐酸”、“嘈杂”、“胃痛”等范畴[6]。中医学多采用整体调理与个体化用药相结合，不仅能改善症状，而且对胃癌前病变会部分逆转，显示出独特的优势[7]。本研究对胃癌前病变模型大鼠应用加味柴芍六君方联合壮医药线点灸治疗，取得了满意的效果。现总结报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料将120只健康清洁级雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、胃复春对照组、中药低剂量组、中药中剂量组及中药高剂量组，均20只。所有实验大鼠均由桂林医学院动物实验中心提供。各组大鼠的体质量、周龄相比，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。具体数据见表1。
表1各组大鼠的体质量、周龄比较
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1.2方法
1.2.1药物制备 应用去离子将N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）配制成浓度为1g·L-1的储备液（每周配制1次），临用时用双蒸水将其配制成浓度为100mg·L-1；把盐酸雷尼替丁胶囊（江西新赣江药业有限公司，国药准字H36021469）加工成质量分数0.03%的雷尼替丁颗粒饲料以供造模；脱氧胆酸钠用双蒸水新鲜配制成200mmol·L-1母液，避光冷藏保存（每周配制1次），用时将其稀释成20mmol·L-1（0.85%）；将胃复春片（杭州胡庆余堂药业有限公司，国药准字Z33020146）研磨成粉末，应用蒸馏水将其配成52.5g·L-1的混悬液；将加味柴芍六君方（由桂林医学院附属医院中药房提供，为单味药分装颗粒剂）溶于热水中并配制成2.26kg·L-1的溶液，将其作为高浓度中药。
1.2.2壮医药线点灸疗法 选穴肝俞、脾俞、胃俞、足三里、内关、中脘（各穴左右交替施灸）等；药线用2号壮医药线（由广西中医学院壮医药推广中心提供）；操作时，患者取坐位或卧位。医者用右手拇指、食指持药线一端，露出线头1～2cm，在酒精灯上点燃线端，并迅速熄去火焰，将带火星的线头直接点按于穴位上，一按火灭即为1壮。一般每穴1壮，每天1次，10次为1个疗程，停2~3 d后，再行下1个疗程，共治疗3个疗程。取穴定位参考《实验针灸学》[8]。
1.2.3模型制备 采用改进后的综合造模法造PLGC模型。具体如下：造模组大鼠进食含0.03%雷尼替丁的颗粒饲料，自第二周起每日自由饮用100mg·L-1的MNNG(饮水瓶用油漆涂黑避光)，上午用55℃的15%盐水按10mL·kg-1灌胃，下午用20mmol·L-1的体积分数0.85%脱氧胆酸钠溶液按10mL·kg-1灌胃并应用禁食1d、进食2d的方法，禁食当天下午应用10mL·kg-1的体积分数40%酒精进行灌胃，灌胃前后1h均禁食、禁水。每周用钳子夹住大鼠的尾部1次，使之保持激怒、争斗状态，持续30min。同时正常组大鼠以生理盐水每天按10mL·kg-1灌胃，与其他组灌胃时间同步。上述方法连续造模24周。
1.2.4药物干预给予空白对照组大鼠正常进食和饮水，其余5组进行造模。造模成功后，给予各组大鼠相应剂量的药物实施干预（中药组同时配合壮医药线点灸外治）。给予胃复春对照组大鼠0.35g·kg-1的胃复春混悬液进行灌胃；给予中药高剂量组大鼠15.06g·kg-1的中药溶液进行灌胃；给予中药中剂量组大鼠7.53g·kg-1的中药溶液进行灌胃；给予中药低剂量组大鼠3.77g·kg-1的中药溶液进行灌胃；模型对照组和空白对照组均应用生理盐水华仁药业股份有限公司，国药准字H20093777）2mL·d-1的灌胃，连续灌胃16周。16周后，各组大鼠均采取禁食不禁水的措施，24h后将其断头处死。
1.3观察指标观察各组大鼠的一般情况（大便、毛色、活动表现、精神、进食量）、体质量变化情况、胃窦黏膜病理组织学、Syk蛋白、突变型p53蛋白及Survivin蛋白的表达情况。
胃窦黏膜病理组织学：将各组大鼠处死后，进行解剖，把胃取出来并沿胃大弯将其切开，使用生理盐水把其洗净，取0.5cm×0.5cm的胃窦部组织，应用体积分数10%甲醛（湖南尔康制药股份有限公司，国药准字H43020198）实施固定。常规应用石蜡进行包埋并连续切片，同时实施HE染色，在光学显微镜下对不典型增生、肠上皮化生、腺体萎缩的发生情况进行观察。突变型p53蛋白及Syk蛋白：应用免疫组化S-P法对突变型p53蛋白及Syk蛋白的表达情况实施检测。用显微镜进行观察，胞膜、胞浆或胞核为棕黄色颗粒则为阳性[9]。Survivin蛋白：应用免疫组化S-P法对Survivin蛋白的表达情况进行检测，操作步骤严格按照试剂盒操作说明书按照阳性细胞的数量及染色反应的深度分别记为0~3分。3分：棕褐色或阳性细胞数量＜10%；2分棕黄色或阳性细胞数量46%-70%；1分：浅黄色或阳性细胞数量46%~70%；0分：不着色或阳性细胞数量＞70%，按照阳性细胞的数量及染色反应深度的积分分为强阳性（5~6分）、阳性（3~4分）、弱阳性（2分）、阴性（0分）[10]。
1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件进行数据处理，各组大鼠体质量等计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，Syk蛋白、Survivin蛋白、p53蛋白表达等计数资料用百分比表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠一般情况 造模期间，空白对照组大鼠毛色、大便、耳朵黏膜色泽、进食量等方面良好，精神佳，好动；其余5组大鼠毛色变黄，大便溏结不调，耳朵黏膜色泽差，进食量减少，精神萎靡，反应迟钝。药物干预期间，中药中、高剂量组的上述症状基本消失，干预6周后恢复正常；胃复春对照组及中药小剂量组上述症状有所改善，但改善效果没有中药中、高剂量组明显；模型组毛色发黄，大便溏结不调，耳朵黏膜色泽差，进食量减少，精神萎靡，反应迟钝。
2.2各组大鼠体质量变化情况 药物干预前，和空白对照组相比，其余5组大鼠体质量均较低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；其余5组大鼠体质量相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；药物干预后，和空白对照组相比，其余5组大鼠体质量均明显较低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和模型组相比，胃复春对照组、中药低、中、高剂量组大鼠的体质量均明显较高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中药中、高剂量组大鼠体质量明显高于胃复春对照组及中药低剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；药物干预后和干预前相比，模型组大鼠体质量明显下降，而剩余5组均明显上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。具体数据见表2。
表2各组大鼠药物干预前、后体质量变化情况对比（g）
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注：和空白对照组相比，aP＜0.05；和模型组相比，bP＜0.05；和胃复春对照组相比，cP＜0.05；和本组干预前相比，dP＜0.05
2.3各组大鼠病理情况比较 和空白对照组相比，其余5组大鼠的腺体萎缩、肠上皮化生、不典型增生发生例数均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和模型组相比，中药高剂量组的肠上皮化生、腺体萎缩的发生情况均明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中药低、中、高剂量组、胃复春对照组大鼠的不典型增生发生情况相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。具体数据见表3。病理照片见图1-图6。
表3各组大鼠胃黏膜病理变化情况对比n（%）
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注：和空白对照组相比，aP＜0.05；和模型组相比，bP＜0.05
2.4各组大鼠Syk蛋白表达情况比较 和空白对照组相比，其余5组大鼠Syk蛋白阳性表达情况明显减少，阴性表达情况明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和模型组相比，中药中、高剂量组、胃复春对照组大鼠Syk蛋白阳性表达情况明显增加，阴性表达情况明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和胃复春对照组相比，中药高剂量组大鼠Syk蛋白阳性表达情况明显增加，阴性表达情况明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。具体数据见表4。
表4各组大鼠Syk蛋白表达情况比较 只（%）
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注：和空白对照组相比，aP＜0.05；和模型组相比，bP＜0.05；和胃复春对照组相比，cP＜0.05
2.5各组大鼠Survivin蛋白表达情况比较 和空白对照组相比，其余5组大鼠Survivin蛋白阳性表达情况明显增加，阴性表达情况明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和模型组相比，胃复春对照组、中药中、高剂量组大鼠Survivin蛋白阳性表达情况明显减少，阴性表达情况明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和胃复春对照组相比，中药高剂量组大鼠Survivin蛋白阳性表达情况明显减少，阴性表达情况明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。具体数据见表5。
表5各组大鼠Survivin蛋白表达情况比较 只（%）
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注：和空白对照组相比，aP＜0.05；和模型组相比，bP＜0.05；和胃复春对照组相比，cP＜0.05
2.6各组大鼠p53蛋白的表达情况比较 和空白对照组相比，其余5组大鼠p53蛋白阳性表达情况明显增加，阴性表达情况明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；和模型组相比，胃复春对照组、中药高剂量组大鼠p53蛋白阳性表达情况明显减少，阴性表达情况明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。具体数据见表6。
表6各组大鼠p53蛋白表达情况对比n（%）
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注：和空白对照组相比，aP＜0.05；和模型组相比，bP＜0.05
3讨论
胃癌是源自胃黏膜上皮的一种恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤的第3位，占消化道恶性肿瘤的首位[11]。我国胃癌的发病率较高，每年新发现约40万胃癌患者，约占世界发病人数的42%，给人类的健康带来极大的威胁。胃癌前病变是病理概念，包括异型增生、肠上皮化生，主要伴存于慢性萎缩性胃炎，患者临床常表现出上腹饱胀、胃纳减退、胃出血、贫血、嗳气等症状。据相关文献报道，胃黏膜发生癌变是慢性浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌的过程，并非从正常细胞一下变成癌细胞的[12]。胃癌前病变是非特异型过程，细胞的退化、增殖长期共存是其主要特征，DNA的损伤和修复、核酸的代谢虽然会出现欠缺，但这些都是可逆的过程。据相关文献报道，应用中医药对胃癌前病变患者进行治疗，可增强胃黏膜屏障，对胃肠运动及免疫功能进行调节，对胆汁的反流实施有效的阻止，对基因或蛋白质的表达具有一定程度的影响作用，可有效促进萎缩腺体得人恢复[13]。
中医学暂无胃癌前病变的病名，但根据其临床表现，部分学者将其归属于“吐酸”“嘈杂”“痞满”“胃痛”等范畴，正如《伤寒论》中的记载“但满而不痛者，此为痞......心下痞，按之濡”。大多数学者认为，脾胃虚弱是胃癌前病变发病的基础，本虚标实，虚实夹杂是其病机特点，本病以脾胃气虚为主，标实则有气滞、湿阻、血瘀、热毒等[14]。治疗上则以健脾益气、理气消胀、活血化癖、养阴增液、清热解毒、化痰软坚等为常见治法。相关研究表明，胃癌前病变的发病当以脾胃虚弱为本，兼见气滞肝郁，日久则湿热、瘀毒内生,以致病程缠绵，反复难愈[15]。临床上辨证以脾虚肝郁者多见，认为其关键病机为“脾虚气滞、瘀毒内蕴”，治疗当以“健脾疏肝、化瘀解毒”为法。胃癌前病变当属壮医谷道病范畴，壮医“虚毒治病论”认为本病多为正气不足，谷道虚弱，毒邪内侵而发病。临床在口服中药的同时配以壮医药线点灸外治调气解毒，选穴肝俞、脾俞、足三里、胃俞、内关、中脘等，利用局部刺激,通过龙路、火路传导，一方面直接祛毒外出，调节人体气血平衡；另一方面调整脏腑功能，提高机体免疫力。壮医药线点灸是壮医调气解毒的常用外治法，把壮药泡制的苎麻线点燃后，直接灼灸患者体表的一定部位或穴位，从而对疾病进行有效的治疗[16]。其机制是对三道两路（谷道、水道、气道、龙路、火路）在体表穴位的刺激，通过道路传导来调节气血归于平衡，促进脏腑器官正常功能的恢复，进而将疾病治愈。
本研究中加味柴芍六君方药物组成为茯苓、白术、甘草、党参、陈皮、柴胡、半夏、白芍、莪术、丹参、蒲公英、半枝莲、白花蛇舌草等。党参是一种桔梗科党参属多年生草本植物。党参性平，味甘、微酸，具有补中益气，健脾益肺等功效，正如《本草从新》中记载：“补中益气，和脾胃除烦渴。”《纲目拾遗》记载：“治肺虚，益肺气。”柴胡是一种清虚热中药，始载于《神农本草经》，列为上品。柴胡性微寒、味苦、辛，有疏气解郁、疏肝利胆、散火之功效[17]。茯苓为寄生在松树根上的菌类植物，出自《神农本草经》。茯苓性平，味甘淡，具有健脾和胃、渗湿利水、宁心安神之功效，正如《神农本草经》记载：“主胸胁逆气，......口焦舌干，利小便。”白花蛇舌草、半枝莲、蒲公英清热祛毒，促进黏膜病变的修复；莪术、丹参活血通络，使脾胃脉络通畅、瘀滞消除；陈皮、半夏理气化湿和胃[18]。
对胃癌前病变的分子生物学机制及中医药逆转胃黏膜癌前病变的机制研究，对胃癌防治具有重要意义。在抑制细胞增殖和调节基因表达方面，现代医学研究认为，最大程度减少环境致癌因素的作用，可有效对胃癌前病变进行逆转，但其细胞本身的修复机制更为重要[19]。Syk是一种候选抑癌基因，其缺失会造成免疫细胞发育、成熟障碍，从而使肿瘤易于发生。p53是一种肿瘤抑制基因，主要存在于细胞核浆中，可与DNA特异结合。据相关文献报道，正常的胃黏膜细胞内并不存在突变型p53蛋白的表达，但在慢性萎缩性胃炎向肠上皮化生过程中、异型增生阶段其阳性表达率显著上升，可达60%左右[20]。所以，突变型p53蛋白可对慢性萎缩性胃炎异型增生、肠上皮化生程度进行直接反映。Survivin是一种凋亡抑制蛋白，在浅表→萎缩→异型增生过程中，Survivin蛋白表达呈递增趋势。因此，可以认为增强Syk蛋白的表达和减弱Survivin蛋白、p53蛋白的表达，可提高胃癌前病变的治疗效果。本研究中，和模型组相比，胃复春对照组、中药高剂量组大鼠Syk蛋白阳性表达明显增加，阴性表达明显减少，而Survivin蛋白、p53蛋白阳性表达情况明显减少，阴性表达情况明显增加；和胃复春对照组相比，中药高剂量组大鼠Syk蛋白阳性表达情况明显增加，阴性表达情况明显减少，而Survivin蛋白阳性表达例情况显减少，阴性表达情况明显增加。说明对胃癌前病变模型大鼠应用加味柴芍六君方联合壮医药线点灸治疗，可增强Syk蛋白的表达和减弱Survivin蛋白、p53蛋白的表达。
综上所述，对胃癌前病变模型大鼠应用加味柴芍六君方联合壮医药线点灸治疗，可显著提高治疗效果，而增强Syk蛋白的表达和减弱Survivin蛋白、p53蛋白的表达，可能是其作用机制。
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作者简介：蒋敏玲（1983-），女，广西桂林人，医学硕士，主治医师，讲师，研究方向：中医药治疗脾胃病。
基金项目：广西自然科学基金面上项目（2012GXNSFAA053078）
工作单位：桂林医学院附属医院中医科，联系电话：15878391987，邮箱：jiangminling1983@sina.com，通讯地址：桂林市秀峰区乐群路15号桂林医学院附院中医科，邮编：541515
